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直接多肽反应试验在化妆品检测中的应用

文章出处:威尼斯人app 人气:发表时间:2020-10-13 12:03

  (上海出入境检验检疫局 动植物与食品检验检疫技术中心,上海 200135)

  摘 要:以OECD指南为基础,在实验室建立直接多肽反应试验(DPRA)方法并进行实验室内验证,同时评估该方法对测试化妆品配方致敏反应的可能性。依据OECD TG 442C指南,将受试物(包括化学品和化妆水配方)分别与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽以10∶1和50∶1的比例避光孵育24 h,采用高效液相色谱法分析两种多肽的消耗,计算多肽消耗率并依据DPRA预测模型对受试物致敏性进行判定。由试验结果可知,DPRA可准确区分16种化学品的致敏性,检测结果与OECD TG 442C指南及文献中小鼠淋巴结试验(LLNA)结果一致;DPRA对3种化妆水配方检测结果分别为致敏物、致敏物、非致敏物,与多肽反应程度分别为中、低和无。

  过敏性接触性皮炎是皮肤对外源物质产生的免疫原性皮肤反应,主要的反应特征为瘙痒、红斑、丘疹等,因此皮肤过敏性评价是化学品分类标识、化妆品毒理学评价的重要内容[1]。传统的皮肤致敏试验包括豚鼠局部封闭涂皮试验和最大值试验,2002年小鼠淋巴结试验(local lymph node assay,LLNA)被OECD采纳作为皮肤致敏试验的替代方法,它采用细胞学指标观察小鼠局部暴露后淋巴细胞增殖情况,减少了实验动物数量[2]。

  近年来,在评估毒性作用的模式框架中提出了有害结局通路(adverse outcome pathway, AOP)的概念,2007年“21世纪毒性测试:愿景与策略(Toxicity Testing in the 21stCentury,TT21C)”的发表推动了AOP的研究和应用。皮肤致敏的AOP通路见图1,其分子起始事件是外源物质渗入表皮层与皮肤蛋白共价结合形成半抗原复合物,随后角质形成细胞激活发生炎性反应,同时被激活的树突状细胞迁移至局部淋巴结,将半抗原复合物呈递至T淋巴细胞,最终导致T细胞的增殖和分化。当皮肤再次接触相同过敏原时进入激发阶段,触发炎性反应[3]。目前,基于AOP关键事件开发的替代方法有直接多肽反应试验(direct peptide reactivity assay,DPRA)[4]、角质细胞ARE-Nrf2荧光素酶检测方法[5]和人细胞系活化试验(human cell line activation test,h-CLAT)[6]。

  DPRA方法是针对皮肤致敏AOP起始事件建立的体外替代方法,2015年被收录至OECD TG 442C指南。DPRA的检测结果与LLNA数据一致性达到89%,不同实验室间再现性良好[4],但目前DPRA只用于对单一化学品和化妆品原料进行检测,对化妆品产品的检测未见报道,而我国化妆品法规标准要求针对化妆品产品进行检测。本研究旨在转化和建立DPRA方法,并进行实验室内部验证,在此基础上采用DPRA对化妆品配方进行致敏性检测,为DPRA在化妆品产品检测中的应用提供依据。

  人工合成半胱氨酸多肽(Ac-RFAACAA-COOH,分子量751.9,纯度95%)和赖氨酸多肽(Ac-RFAAKAA-COOHA,分子量776.2,纯度95%),苏州强耀生物有限公司;乙腈(色谱纯),三氟乙酸(TFA)、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、乙酸铵、氨水(分析纯),Sigma公司。

  受试样品:恶唑酮、2,4-二硝基氯苯(2,4-Dinitrochlorobenzene,DNCB)、对苯醌、甲氨基酚硫酸盐、乙二醛、肉桂醛、苯亚甲基丙酮、2,3-丁二酮、甲醛、金合欢醛、丁香油酚、1-丁醇、6-甲基香豆素、4-甲氧基苯乙酮、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油,均为分析纯, Sigma公司;化妆水,自制(配方成分见1.2.6)。

  配制pH为10.2的100 mmol·L-1乙酸铵缓冲液;配制高效液相色谱流动相A:1 mL三氟乙酸加入至1 L色谱纯水中;配制高效液相色谱流动相B:850 μL三氟乙酸加入至1 L色谱纯乙腈中。

  受试样品均配制成摩尔浓度为100 mmol·L-1溶液,体积3 mL。溶剂首选乙腈,若不溶解,可尝试溶解于水、水/乙腈(1∶1)、异丙醇、丙酮、丙酮/乙腈(1∶1),也可溶解于300 μL二甲基亚砜后用2 700 μL乙腈稀释,或用1 500 μL二甲基亚砜溶解后用1 500 μL乙腈稀释。

  采用乙腈为溶剂分别配制100,50,10和1 mmol·L-12,4-二硝基氯苯溶液(典型皮肤致敏阳性参照物)用于后续DPRA对2,4-二硝基氯苯剂量-反应关系评价。

  0.667 mmol·L-1半胱氨酸多肽溶液:称取12.5 mg半胱氨酸多肽溶解于25 mL磷酸盐缓冲液中。

  0.667 mmol·L-1赖氨酸多肽溶液:称取12.9 mg赖氨酸多肽溶解于25 mL乙酸铵缓冲液中。

  将8 mL磷酸盐缓冲液和8 mL乙酸铵缓冲液分别与2 mL乙腈混合配制成稀释缓冲液。取1 600 μL 0.667 mmol·L-1多肽溶液加入到400 μL乙腈中配制成标准母液。将标准母液与稀释缓冲液等比例稀释混合配制摩尔浓度分别为0.534,0.267,0.133 5,0.066 7,0.033 4,0.016 7和0 mmol·L-1的标准曲线 空白对照、共洗脱对照、样品制备

  取1 mL进样瓶,半胱氨酸多肽及赖氨酸多肽分别与受试物以1∶10(0.5 mmol·L

  多肽,5 mmol·L-1受试物)及1∶50(0.5 mmol·L-1多肽,25 mmol·L-1受试物)比例混合,按表1加入试剂,混匀,每个样品、对照均平行制备3份。进样瓶置室温下避光孵育24 h后分别用高效液相色谱进行检测。

  3种自制化妆水配方组成见表2。依据化妆水组分(除水外)计算平均相对分子量,配制100 mmol·L

  柱温25 ℃,进样量10 μL,流动相流速为1 mL/min, 梯度洗脱,于220 nm处检测多肽峰面积。HPLC洗脱条件见表3。

  对受试物进行判定(见表4)。判断受试物为非致敏物的阈值为6.38%,当6.38%<消除率≤22.62%时,反应程度为低,当22.62%<消除率≤44.4%时,反应程度为中,大于42.47%时反应程度为高。当受试物与赖氨酸多肽发生共洗脱时,仅采用半胱氨酸多肽消除率进行判断,非致敏物阈值为13.89%,致敏物反应程度划分为低、中、高。

  。大多数致敏原(或其代谢产物)为具有亲电性的小分子化合物(分子量小于500 Da),能与具有亲核试剂结合形成共价键。蛋白质中许多氨基酸侧链具有亲核性,能与致敏原结合。目前研究发现能与亲核试剂结合的氨基酸有半胱氨酸、赖氨酸、谷胱甘肽、甲硫氨酸等[8,9]。DPRA试验模拟了半抗原化这一过程,使用化学方法模拟致敏原与合成半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽的结合,运用高效液相色谱测定两种多肽的消耗情况,根据多肽消耗率来预测受试物的致敏能力[9,10]。2.1 DPRA方法的建立及对化学品致敏性检测

  ,其中SDS是典型的具有刺激性但无致敏性的物质,DPRA对其检测结果没有出现假阳性。乙二醛、肉桂醛、苯亚甲基丙酮、2,3-丁二酮被DPRA划分为致敏物,但反应程度都比LLNA高,甲醛则相反。多数化合物与多肽反应程度偏高的原因可能在于DPRA只基于皮肤致敏中的起始事件,皮肤致敏机理还包括AOP中其他关键事件[9],物质透皮能力较差、T细胞对其免疫反应较弱等原因都可能降低化合物的致敏等级。约有1/3的已知致敏物为半抗原前体,不具有直接反应性,需要经过氧化或酶代谢活化后才能与含有亲核氨基酸的蛋白质结合

  。DPRA方法面临的一个重要挑战就是缺乏代谢体系,对需酶代谢的半抗原前体会出现假阴性[13]。本研究测试的化合物甲氨基酚硫酸盐和丁香油酚,需经空气氧化后与蛋白质反应,本检测区分为致敏物,与实际结果相符[11,13],说明DPRA可能对空气氧化活化途径的化学物有预测能力[9]。为了解决对半抗原前体这一类致敏原的检测,有研究将代谢活化系统(辣根过氧化物酶)加入到DPRA试验中,降低了DPRA方法的假阴性率,扩大DPRA的检测范围[13,14]。2.2 DPRA对2,4-二硝基氯苯剂量-反应关系评价

  的DNCB与两种多肽孵育,DNCB与半胱氨酸多肽结合反应强烈,多肽消除率分别为100%,100%,100%,16.5%;而采用赖氨酸多肽检测时DNCB的剂量-反应相关性较好,分别为27.1%,24.5%,6.7%,1.4%,不同浓度DNCB的多肽平均消除率分别为63.6%,62.3%,53.3%,9.0%。半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽分别含有SH基团和NH2基团,致敏物与这两个基团反应活性可能存在差异。半胱氨酸多肽是软亲核试剂,对多数致敏物比赖氨酸多肽更为敏感,而赖氨酸作为一个硬亲核试剂,对硬亲电试剂如邻苯二甲酸酐、磺内酯类、甲基异噻唑啉酮衍生物具有更好的反应选择性[9,15]。基于本研究结果,DPRA对不同浓度DNCB具有较高的灵敏度,特别是与半胱氨酸多肽的反应,以两种多肽的消除率平均值作为判断与多肽反应程度的依据,可以更好预测受试物的致敏作用。2.3 DPRA对化妆水致敏性检测

  DPRA目前主要用于单一化学品或化妆品原料的致敏性评价,还未见其用于化妆品产品检测的报道。而我国的法规及标准要求对化妆品产品进行评价,DPRA的应用受到很大限制。为探索DPRA在化妆品产品检测的应用,本研究以化妆水为代表,在化妆水的基本配方(包含水、甘油、酒精、吐温-80)中分别添加50%,10%,0.2%的肉桂醛,模拟致敏和非致敏化妆品样品,以此观察DPRA对化妆品或混合物中致敏物的剂量-反应关系的检测情况及检测灵敏度。肉桂醛是OECD TG 442C指南DPRA试验中的阳性对照,也是欧盟化妆品法规(EC1223-2009-EU Cosmetics Regulation-In Force)列出的26种香料致敏物之一,要求在不可冲洗型化妆品中含量大于0.001%时需要在标签上予以标注。我们采用建立的DPRA方法对3种化妆水进行检测,多肽反应程度分别为中、低和无。结果具有一定的剂量-反应关系,并能够区分出高中剂量组的与多肽反应性,说明DPRA具有对混合物及化妆品产品进行预测的潜力。

  当前DPRA用于化妆品产品的挑战主要来源于两个方面,一方面是许多产品组分复杂,在HPLC检测中有可能与多肽共出峰,难以对多肽准确定量分析;另一个方面在于OECD指南中规定用受试物的摩尔质量计算加样量,那么对于混合物或未知组分的产品,摩尔质量计算较复杂甚至难以计算,如何确定试验的加样量就成为了一个关键问题。目前DPRA研究都采用原液直接检测混合物产品或植物提取物

  ,容易出现假阳性结果[17]。因此DPRA在化妆品产品检测中的应用还需要大量的实验数据积累,或者是实验条件的优化。3 结论

  本研究进行了DPRA方法在实验室的转化、建立、拓展。DPRA作为OECD认可的体外替代方法,可用于水溶性受试物和非水溶性受试物,通量较高,试验时间较短,对化学品皮肤致敏性预测结果与LLNA结果趋于一致,可作为第一步筛选试验,与其他体外替代方法组合运用。本研究采用DPRA对化妆产品进行致敏性检测,表明了DPRA具有用于产品预测的潜力,拓展了该方法的应用范围,未来将尝试建立对乳液、洁面乳、植物提取物等多种类型化妆品及原料检测的方法,研究试验受试物加样质量,对国内法规的配合有现实意义。

  [1]彭双清,郝卫东,伍一军.毒理学替代方法[M].北京:军事医学科学出版社,2009:80-84.

  [16]柯逸晖,陈彧,程树军,等.直接多肽结合试验组合人细胞系活化试验预测皮肤致敏物的探讨[J].中国实验动物学报,2016,24(6):611-617.

  [17]张劲松,桑晶,孙叶丹,等.直接肽段结合方法在中药注射剂过敏反应预测中的应用[J].中国药品标准,2016,17(4):268-271.

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